Lecture 11: 细胞内区室与蛋白质分选（详细版）

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课程：高等生物科学 | 南方科技大学 | 邓怿教授

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预备知识：理解本讲需要的基础

0.1 蛋白质的基本结构回顾

蛋白质由氨基酸通过肽键（peptide bond）连接而成。每个氨基酸有一个氨基（-NH₂）和一个羧基（-COOH），连接后形成多肽链。多肽链有方向性：N 端（游离氨基端）是合成起始端，C 端（游离羧基端）是合成终止端。核糖体翻译 mRNA 时，总是从 N 端开始，向 C 端延伸。

蛋白质的四级结构：

• 一级结构：氨基酸的线性序列
• 二级结构：局部的规则折叠，主要有α螺旋（α-helix）和β折叠片（β-sheet）
• 三级结构：整条多肽链的三维折叠
• 四级结构：多个亚基的组装

蛋白质的功能高度依赖其三维结构。一个蛋白质如果没有正确折叠，通常会失去功能，甚至形成有毒的聚集体。

0.2 氨基酸的关键性质

本讲中频繁提到的氨基酸性质：

疏水性氨基酸（倾向于远离水，埋在蛋白质内部或嵌入脂双层）：

• 亮氨酸（Leu, L）、异亮氨酸（Ile, I）、缬氨酸（Val, V）、丙氨酸（Ala, A）、苯丙氨酸（Phe, F）、甲硫氨酸（Met, M）

带正电的氨基酸（在生理 pH 下带正电荷）：

• 赖氨酸（Lys, K）、精氨酸（Arg, R）

半胱氨酸（Cys, C）：含 -SH 基团，两个 Cys 可以形成二硫键（-S-S-），对蛋白质折叠和稳定性很重要。

0.3 生物膜的基本性质

细胞膜（包括所有细胞器膜）由磷脂双分子层构成：两层磷脂分子，疏水尾部朝内，亲水头部朝外。这种结构对大多数亲水分子（离子、蛋白质、核酸等）构成了天然屏障。

因此，蛋白质要从细胞质进入一个膜包被的细胞器，要么穿过膜（需要专门的转运通道），要么通过膜泡融合的方式进入。这就是本讲讨论的核心问题。

0.4 GTPase 开关

本讲中多次出现 GTPase（如 SRP/SR 的 GTPase、Ran GTPase）。它们是分子开关：

• GTP 结合态（活化态）：GTPase 与效应分子结合，执行功能
• GDP 结合态（失活态）：GTPase 释放效应分子
• GEF（鸟嘌呤核苷酸交换因子）：促进 GDP → GTP 交换，激活 GTPase
• GAP（GTPase 激活蛋白）：刺激 GTP 水解为 GDP + Pi，失活 GTPase

GTPase 循环的本质是利用 GTP 水解的自由能来驱动构象变化，从而控制分子间相互作用的开与关。

0.5 分子伴侣（Molecular Chaperones）

分子伴侣是一类帮助其他蛋白质正确折叠、防止聚集的蛋白质。本讲涉及的分子伴侣：

• Hsp70 家族（如细胞质的 Hsc70、ER 腔内的 BiP、线粒体基质的 mtHsp70）：结合暴露的疏水区域，防止错误折叠和聚集。需要消耗 ATP 进行结合-释放循环。
• Hsp90：帮助维持某些蛋白质的折叠状态
• Hsp60/Hsp10（Chaperonin）：在线粒体基质中，提供一个封闭的"折叠笼"，让蛋白质在隔离环境中正确折叠

0.6 SDS-PAGE 简介

SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是分离蛋白质的常用方法。SDS 使所有蛋白质带上均一的负电荷，电泳时蛋白质仅按分子量大小分离——分子量越小，跑得越快。本讲中，它被用来区分含信号肽的前体蛋白（较大）和切除信号肽后的成熟蛋白（较小）。

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第一部分：细胞内区室化（Intracellular Compartmentalization）

1.1 为什么真核细胞需要区室化？

这是一个非常基础但重要的问题。原核细胞（如大肠杆菌）只有约 4000 个基因，所有生化反应都在同一个细胞质空间中进行。真核细胞（如人类细胞约有 20000 个基因）需要更精细的组织方式，区室化提供了以下关键优势：

（1）创造不同的生化环境

不同的反应需要不同的条件。例如：

• 溶酶体内部 pH 约 4.5-5.0（酸性），用于水解酶的最适工作条件；而细胞质 pH 约 7.2。如果这些水解酶泄漏到细胞质中，由于 pH 不适合，活性会大幅降低，从而保护细胞。
• ER 腔是氧化环境（有利于二硫键形成），而细胞质是还原环境。分泌蛋白在 ER 中正确形成二硫键后才能获得功能。
• 线粒体基质维持碱性 pH 和高浓度的辅酶，适合三羧酸循环和脂肪酸氧化。

（2）增加反应效率

将相关的酶集中在一个小的区室内，大大提高了底物和酶的局部浓度。例如：

• 脂肪酸β-氧化的酶集中在过氧化物酶体和线粒体中
• 蛋白质糖基化的酶集中在 ER 和高尔基体中

（3）隔离危险反应

• 过氧化物酶体将产生 H₂O₂ 的氧化反应限制在膜内，防止 H₂O₂ 损伤细胞其他组分
• 溶酶体将降解酶封闭起来，防止不受控的细胞自身降解

（4）提供信号调控平台

许多信号通路依赖于蛋白质在不同区室间的转运。例如，转录因子从细胞质转运到细胞核是基因激活的关键步骤（如后文的 NF-AT 实例）。

1.2 各细胞器详细介绍

以肝细胞（hepatocyte）为例，这是一种功能非常活跃的细胞：

值得注意的是，不同类型的细胞，各细胞器的比例差异很大。例如：

• 分泌活跃的细胞（如胰腺腺泡细胞）：粗面 ER 和高尔基体非常发达
• 肌肉细胞：线粒体占比更高
• 解毒功能活跃的肝细胞：滑面 ER 和过氧化物酶体更丰富

1.3 真核细胞内膜系统的演化假说（详述）

现代真核细胞的内膜系统是如何演化而来的？目前的主流假说如下：

第一阶段：膜灵活性的获得

• 起始细胞是一个厌氧古菌（anaerobic archaeon）
• 这个古菌的细胞壁发生退化或丧失，使其质膜变得更加灵活
• 细胞壁的丧失使古菌可以更容易地变形和吞噬

第二阶段：水平基因转移加速

• 没有坚硬细胞壁的灵活细胞更容易摄取周围的 DNA
• 来自古菌和细菌的水平基因转移大大增加
• 这加速了演化过程

第三阶段：内膜系统的形成

• 质膜不断向内折叠（invagination），逐渐将基因组 DNA 包裹起来
• 这些内折的膜最终形成了核膜（nuclear envelope）
• 核膜与质膜之间的连续膜结构演化为内质网（ER）
• 这解释了为什么核膜是双层膜，而且外核膜与 ER 是连续的

第四阶段：线粒体的内共生起源

• 一个好氧细菌（aerobic bacterium，可能是α-变形菌的祖先）被吞入宿主细胞
• 但没有被消化，而是存活下来，形成了原始线粒体（promitochondrion）
• 这种共生关系对双方有利：宿主获得了高效的 ATP 产生能力，细菌获得了保护和营养

支持内共生理论的证据：

• 线粒体有自己的环形 DNA（类似细菌基因组）
• 线粒体有自己的核糖体（70S，类似细菌，而非真核的 80S）
• 线粒体的双层膜：内膜来自原始细菌的质膜，外膜来自吞噬时的宿主质膜
• 线粒体的分裂方式类似细菌二分裂
• 线粒体 DNA 的序列与α-变形菌高度相似

第五阶段：细胞复杂性的爆发

• 线粒体提供的充裕 ATP 使细胞能够长得更大
• 更大的细胞需要更复杂的内膜系统来组织各种生化反应
• 高尔基体、溶酶体、内体等膜结构逐渐分化

> 注意：叶绿体的起源也是内共生——一个光合蓝细菌（cyanobacterium）被吞入，这发生在线粒体内共生之后。植物细胞因此同时拥有线粒体和叶绿体。

1.4 蛋白质在不同区室间的运输流程

细胞中几乎所有蛋白质的合成都始于细胞质中的游离核糖体。那么，蛋白质如何到达正确的目的地？

关键原则：分选信号决定目的地。

蛋白质的运输路线（从细胞质出发）：

                    ┌─→ 细胞核（门控运输，NLS/NES）
                    │
                    ├─→ 线粒体（跨膜运输，前导序列）
                    │
     细胞质 ────────├─→ 过氧化物酶体（跨膜运输，PTS1/PTS2）
   （翻译起始处）    │
                    ├─→ 叶绿体（跨膜运输，转运肽）[仅植物]
                    │
                    └─→ 内质网（ER）──→ 高尔基体 ──┬→ 溶酶体
                         （跨膜运输，     （囊泡运输）├→ 质膜
                          信号肽）                  ├→ 分泌囊泡 → 细胞外
                                                    └→ 内体

例外情况：

• 线粒体和叶绿体自身基因组编码了一小部分蛋白质（线粒体基因组编码约 13 个蛋白质，其余约 1000-1500 个线粒体蛋白由核基因编码并从细胞质进口）
• 没有任何分选信号的蛋白质默认留在细胞质

1.5 三种运输方式的详细比较

（1）门控运输（Gated transport）

• 路径：细胞质 ↔ 细胞核
• 通道：核孔复合体（NPC）
• 货物状态：蛋白质保持折叠态通过（NPC 孔径足够大，约 40 nm）
• 选择性机制：FG 核孔蛋白形成的选择性屏障 + 核转运受体（importin/exportin）
• 能量：Ran-GTP 梯度
• 特点：双向运输（进口和出口同时发生）

（2）跨膜运输（Transmembrane transport / Protein translocation）

• 路径：细胞质 → ER / 线粒体 / 过氧化物酶体 / 叶绿体
• 通道：蛋白质转运通道（translocator/translocon）
• ER：Sec61
• 线粒体外膜：TOM；内膜：TIM23/TIM22
• 叶绿体：TOC/TIC
• 货物状态：蛋白质必须未折叠才能穿过窄小的通道（例外：过氧化物酶体可进口折叠蛋白）
• 能量：ATP（分子伴侣）、GTP（SRP/SR）、膜电位（线粒体）
• 特点：蛋白质像"蛇"一样穿过膜上的通道

（3）囊泡运输（Vesicular transport）

• 路径：ER → 高尔基体 → 溶酶体/质膜/细胞外；以及内吞途径
• 机制：供体膜出芽（budding）形成运输囊泡，囊泡移动到目标膜，与之融合（fusion）
• 货物状态：蛋白质在囊泡内部（腔内蛋白）或嵌在囊泡膜中（膜蛋白），不直接穿过膜
• 关键分子：COPI/COPII/Clathrin 被膜蛋白（coat proteins）、SNARE（膜融合机器）、Rab GTPase（靶向调控）
• 特点：膜的拓扑关系始终保持——ER 腔 = 高尔基体腔 = 囊泡内 = 细胞外

1.6 分选信号（Sorting Signal）的深入理解

分选信号的本质是蛋白质中携带的"地址标签"，告诉细胞的运输机器该蛋白质的目的地。

信号序列（Signal Sequence）的特征：

• 通常是一段连续的氨基酸序列
• 长度通常为 3-60 个氨基酸
• 不依赖精确的氨基酸序列，而是依赖物理化学性质（如疏水性、正电荷）
• 许多信号序列在蛋白质到达目的地后被蛋白酶切除

信号斑（Signal Patch）的特征：

• 由蛋白质三维折叠后，多个在一级序列中不相邻的氨基酸在空间上聚集形成
• 只有在蛋白质正确折叠后才存在
• 不会被切除（切除会破坏蛋白质结构）
• 例子：甘露糖-6-磷酸标记（用于溶酶体酶的分选）

各细胞器信号序列的特征对比：

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第二部分：内质网（ER）蛋白质进口

2.1 历史背景（详述）

ER 蛋白质进口的研究是细胞生物学的经典故事，跨越了半个世纪。

Albert Claude（1899-1983） 和 Keith Roberts Porter（1912-1997）

20 世纪 40 年代，Claude 在洛克菲勒大学率先将细胞匀浆和差速离心技术应用于细胞生物学。他将细胞打碎后，通过不同转速的离心，分离出不同大小的细胞组分：低速沉淀（细胞核和碎片）、中速沉淀（线粒体）、高速沉淀（微粒体=ER 碎片）。

Porter 随后利用当时刚发展起来的电子显微镜，首次清晰地拍摄到了细胞内的膜结构网络，并将其命名为"endoplasmic reticulum"（内质网，意为"细胞质内的网状结构"）。

George Palade（1912-2008）

Palade 用电子显微镜进一步研究了 ER 的超微结构。他的关键发现：

• ER 膜上附着着大量核糖体（ribosomes），呈"小黑点"状——这就是粗面 ER（rough ER）
• 没有核糖体附着的 ER 是滑面 ER（smooth ER）
• 通过放射性同位素追踪实验，他揭示了分泌途径（secretory pathway）：蛋白质在粗面 ER 合成 → 运输到高尔基体 → 包装到分泌囊泡 → 释放到细胞外

Claude、Palade 和 Christian de Duve（发现溶酶体和过氧化物酶体）共同获得了 1974 年诺贝尔生理学或医学奖。

> Palade 提出的关键问题："为什么核糖体附着在 ER 上，而不附着在线粒体上？"这个问题的答案需要等到 Blobel 的工作才被揭示。

Günter Blobel（1936-2018）

Blobel 是信号肽假说（signal hypothesis）的提出者和证明者。他的核心发现：

1. 信号肽假说（1971 年提出）：蛋白质的 N 端含有一段特殊的信号序列，决定其是否进入 ER。带有信号肽的蛋白质被特异性地引导到 ER 膜上翻译。 2. 用体外翻译系统证明了信号肽的存在和功能 3. 概括性地提出：所有跨膜运输的蛋白质都携带"拓扑发生信号"（topogenic signals），决定其在膜中的位置和方向

Blobel 因此获得 1999 年诺贝尔生理学或医学奖。

2.2 体外翻译实验的详细解析

这个实验是理解信号肽假说的基础。让我们一步步拆解：

实验材料：

1. mRNA：编码一种分泌蛋白（例如免疫球蛋白轻链）的 mRNA。可以从分泌活跃的细胞中提取，也可以体外转录获得。 2. 翻译系统：兔网织红细胞裂解液（rabbit reticulocyte lysate）。网织红细胞是即将成熟的红细胞，细胞质中充满了核糖体、tRNA、翻译因子和 ATP/GTP 等——是一个完美的无细胞翻译系统。 3. 微粒体（microsomes）：通过差速离心从细胞匀浆中分离的 ER 碎片。匀浆时 ER 断裂，但由于膜的自密封性质，断裂的 ER 会自发形成封闭的小囊泡（微粒体）。微粒体保留了 Sec61 转运通道和信号肽酶。

微粒体的分离方法：

• 将细胞匀浆
• 低速离心去除细胞核和碎片
• 高速离心（100,000 × g）沉淀微粒体
• 蔗糖密度梯度离心进一步分离粗面微粒体（密度大，含核糖体）和滑面微粒体（密度小）

实验设计（两组对照）：

结果分析（SDS-PAGE）：

• 无微粒体组：凝胶上出现一条分子量较大的条带——这是前体蛋白（precursor），包含信号肽
• 有微粒体组：凝胶上出现一条分子量较小的条带——这是成熟蛋白（mature protein），信号肽已被切除
• 两者的分子量差异约 1.5-3 kDa，正好对应信号肽的大小

进一步实验——蛋白酶保护实验：

在有微粒体的条件下翻译后，加入蛋白酶（如蛋白酶 K）：

• 如果蛋白质已经被转运到微粒体内部，膜会保护它不被降解
• 如果蛋白质还在微粒体外面，会被蛋白酶降解

结果：成熟蛋白被微粒体膜保护（不被降解），证明它确实被转运到了微粒体腔内。

如果先用去污剂（detergent）破坏微粒体膜再加蛋白酶，成熟蛋白也会被降解——进一步证明保护来自于膜。

Blobel 的"读出实验"（Readout experiment）：

这是一个更精巧的实验设计： 1. 先在无微粒体条件下开始翻译，使核糖体-mRNA-新生链复合物（RNC）积累 2. 用去污剂从微粒体膜上提取核糖体（这些核糖体正在翻译，被"冻结"在不同的翻译阶段） 3. 将这些 RNC 放入新的翻译系统中继续翻译（"读出"剩余序列） 4. 分析产物：有些是前体蛋白（信号肽还在），有些是成熟蛋白（信号肽已被切除）

这个实验证明了信号肽的切除发生在翻译过程中，即共翻译切除。

2.3 N-端信号序列的深入分析

信号肽的三段式结构（详细版）：

N ──[ n 区 ]──[ h 区（疏水核心） ]──[ c 区 ]──↓切割位点── 成熟蛋白 ── C
     正电荷     6-15个疏水氨基酸       含SPase切割位点
     1-5 aa     (Leu, Ile, Val,       小侧链aa在-1和-3位
                 Ala, Phe等)           (Ala, Gly, Ser)

各区域的功能：

n 区（N-terminal region）：

• 长度：1-5 个氨基酸
• 含 1-2 个带正电的氨基酸（Lys 或 Arg）
• 功能：帮助信号肽正确插入 Sec61 通道。正电荷与 Sec61 通道入口处的负电荷相互作用，促进插入。同时，正电荷遵循"正电荷内侧规则"，确保 N 端留在细胞质侧。

h 区（Hydrophobic core）：

• 长度：6-15 个氨基酸
• 全部或几乎全部为疏水氨基酸
• 这是信号肽最关键的区域——SRP54 的 M 域（methionine-rich domain）识别的就是这段疏水核心
• 功能机制：疏水核心可以形成α螺旋，与 SRP54 的疏水口袋结合。之后，疏水核心通过 Sec61 的侧向门插入脂双层。

c 区（C-terminal region / Cleavage region）：

• 长度：3-7 个氨基酸
• 遵循 "-3, -1 规则"：切割位点上游第 -1 位和第 -3 位必须是小侧链氨基酸（通常是 Ala、Gly 或 Ser）。这是信号肽酶（SPase）识别切割位点的关键。
• 信号肽酶切除信号肽后，切割位点处成为新的 N 端

为什么信号肽没有共识序列（consensus sequence）？

不同蛋白质的信号肽在氨基酸序列上几乎没有相似性。这是因为信号肽的功能不依赖于特定的氨基酸，而依赖于物理化学性质——特别是足够长的连续疏水区段。这也是为什么可以用人工设计的疏水肽段替代天然信号肽，仍然能功能性地引导蛋白质进入 ER。

2.4 SRP 的结构与功能（详述）

SRP 的组成（真核生物，以哺乳动物为例）：

SRP 是一个核糖核蛋白复合物（ribonucleoprotein），由 6 个蛋白质亚基和 1 个 RNA 分子组成：

SRP 的形状像一个细长的"热狗"，中间有铰链（hinge），可以弯折。信号肽结合口袋在一端（SRP54），翻译暂停域在另一端（SRP9/14）。

SRP 识别信号肽的分子机制：

SRP54 的 M 域（methionine-rich domain）形成一个疏水口袋。甲硫氨酸的侧链（-CH₂-CH₂-S-CH₃）灵活且疏水，可以适应不同序列的信号肽——就像一只"灵活的手套"，可以包裹住各种形状的疏水肽段。这解释了为什么 SRP 能够识别序列差异很大的信号肽。

翻译暂停（Elongation arrest）的意义：

当 SRP 结合信号肽后，SRP9/14 与核糖体的因子结合位点相互作用，减慢或暂停翻译延伸。这一步骤至关重要，因为：

1. 防止过早折叠：如果翻译继续而蛋白质还在细胞质中，新生多肽可能开始折叠或与其他蛋白质相互作用，形成无法通过 Sec61 窄通道的结构。 2. 提供时间窗口：给 SRP-RNC 复合物足够的时间找到 ER 膜上的 SRP 受体。 3. 防止聚集：疏水信号肽如果暴露在细胞质的水性环境中太久，可能导致蛋白质聚集。

> 原核生物的类似物：细菌也有 SRP 系统，但更简单——只有一个蛋白质 Ffh（SRP54 的同源物）和一个 4.5S RNA。细菌 SRP 不引起翻译暂停（细菌细胞很小，核糖体到质膜距离短）。

2.5 SRP-SR 相互作用与 GTP 调控（详述）

SRP 受体（SR）的结构：

SRP 受体是一个异二聚体，位于 ER 膜上：

• SRα：外周膜蛋白，含 GTPase 域，与 SRP54 的 GTPase 域相互作用
• SRβ：跨膜蛋白，含另一个 GTPase 域，将 SR 锚定在 ER 膜上

GTPase 双开关机制：

SRP54 和 SRα 各自含有一个 GTPase 域。它们的工作方式与经典的 Ras 家族 GTPase 不同——SRP 和 SR 相互作为对方的 GAP：

1. 在细胞质中：SRP54 结合 GTP，SRα 也结合 GTP 2. SRP 与 SR 对接：两个 GTPase 域直接接触，形成一个共享的活性位点 3. 信号肽转移：SRP 释放信号肽，信号肽被转交给 Sec61 通道 4. GTP 水解：两个 GTPase 相互刺激对方水解 GTP → GDP + Pi 5. 解离：GTP 水解后，SRP 与 SR 解离。SRP 回到细胞质，SR 留在 ER 膜上

这个双 GTPase 机制确保了高保真度——只有当 SRP 正确携带了含信号肽的核糖体，并与 SR 正确对接时，GTP 才会被水解。这避免了空载的 SRP 或不含信号肽的核糖体被错误地靶向到 ER。

2.6 Sec61 转运通道的结构与功能（详述）

Sec61 的三维结构（来自 X 射线晶体学和冷冻电镜）：

Sec61α 是核心亚基，有 10 个跨膜α螺旋（TM1-TM10）。这 10 个螺旋分为两半（TM1-5 和 TM6-10），像两扇"蛤壳"一样围成一个通道。

关键结构元件：

堵头（Plug）：

• 位于通道腔侧（ER 腔侧）
• 是一个短的α螺旋（α2a，约 10 个氨基酸）
• 在静息状态下，堵头堵住通道出口
• 功能：防止小分子和离子泄漏。ER 腔中 Ca²⁺ 浓度比细胞质高约 5000 倍，如果通道不关闭，Ca²⁺ 会大量外流，破坏细胞信号
• 当信号肽插入通道后，堵头被推开（displaced），通道打开

侧向门（Lateral gate / Seam）：

• TM2b 和 TM7 之间有一条"缝"
• 在信号肽插入后，侧向门打开，让疏水的信号肽和跨膜区域从通道"溜"到脂双层中
• 对于分泌蛋白：信号肽通过侧向门离开通道后被信号肽酶切除
• 对于膜蛋白：跨膜区域通过侧向门永久嵌入脂双层

环缢（Pore ring）：

• 通道最窄处有 6 个疏水氨基酸（多为异亮氨酸）的侧链朝向通道中心
• 形成一个疏水密封，在通道开启时包裹住穿过的多肽链
• 防止小分子从通道壁渗漏

Sec61 如何工作——一个统一模型：

1. 静息态：堵头关闭通道，侧向门关闭，通道密封 2. 核糖体对接：翻译中的核糖体对接到 Sec61 的细胞质面。核糖体的出口隧道正好对准 Sec61 通道的入口。 3. 信号肽插入：信号肽作为α螺旋插入通道，与通道壁的疏水残基相互作用 4. 堵头打开：信号肽推开堵头，通道腔侧开放 5. 侧向门打开：信号肽通过侧向门进入脂双层 6. 肽链穿过：后续的多肽链通过通道进入 ER 腔 7. 信号肽切除：信号肽酶切除信号肽 8. 通道关闭：翻译完成后，核糖体脱离，堵头回位，通道重新密封

2.7 共翻译转运 vs 翻译后转运（详述）

共翻译转运（Co-translational translocation）——主要方式：

在哺乳动物细胞中，大多数进入 ER 的蛋白质使用共翻译转运。整个过程可以总结为 8 个步骤：

1. mRNA 在细胞质中开始翻译 2. 信号肽从核糖体出口隧道中冒出（约翻译 70 个氨基酸后，信号肽刚好露出） 3. SRP 识别并结合信号肽 4. SRP 与核糖体结合，暂停翻译 5. SRP-RNC 复合物靶向 ER 膜上的 SRP 受体 6. GTP 水解驱动 SRP 释放信号肽，核糖体转移到 Sec61 上 7. 翻译恢复，新生肽链边翻译边穿过 Sec61 进入 ER 腔 8. 信号肽酶切除信号肽，蛋白质在 ER 腔中折叠，核糖体脱离

优势：蛋白质边合成边转运，不需要在细胞质中维持未折叠状态。

翻译后转运（Post-translational translocation）——酵母中更常见：

某些小的分泌蛋白（特别是在酵母中），由于翻译速度快，SRP 来不及识别就翻译完成了。这些蛋白通过翻译后转运进入 ER。

关键差异：

• 不需要 SRP 和 SRP 受体
• 蛋白质在细胞质中完全翻译完成
• 需要细胞质 Hsp70 分子伴侣维持蛋白质的未折叠状态
• 需要 Sec62-Sec63 复合物帮助蛋白质对接到 Sec61 上
• BiP（ER 腔内的 Hsp70 分子伴侣）通过"棘轮机制"拉动蛋白质进入 ER 腔

BiP 的棘轮机制（Brownian ratchet）： 1. 多肽链通过热运动（布朗运动）在 Sec61 通道中双向随机移动 2. 当一段多肽露出通道的腔侧时，BiP-ATP 结合该段多肽 3. BiP 水解 ATP 变为 BiP-ADP，紧紧抱住多肽 4. 多肽不能再往回退（被 BiP "锁住"） 5. 下一段多肽继续随机运动露出...重复以上过程 6. 最终，蛋白质被逐步"拉"入 ER 腔

这类似于一个棘轮：允许单方向运动，阻止反方向运动。每次 BiP 结合都消耗一个 ATP，因此翻译后转运是一个耗能过程。

2.8 膜蛋白拓扑结构的建立（全面详解）

膜蛋白的拓扑结构（topology）指的是蛋白质的哪些部分在细胞质侧、哪些在 ER 腔侧、以及有多少个跨膜区域。拓扑结构在蛋白质合成时就确定了，后续不再改变。

理解拓扑学的一个核心关系：

• ER 腔 = 高尔基体腔 = 囊泡内部 = 细胞外
• 细胞质 = 细胞质

这是因为囊泡运输保持了膜的方向性。所以：

• Type I 膜蛋白的 N 端在 ER 腔 = 成熟后 N 端在细胞外
• 膜蛋白的细胞质面结构域参与细胞内信号传导

Type I 膜蛋白的合成过程（以 LDL 受体为例）：

1. N 端信号肽出现 → SRP 识别 → 靶向 ER 膜 → 信号肽作为起始转移序列（start-transfer sequence）插入 Sec61 2. 翻译继续，蛋白质穿过通道进入 ER 腔 3. 信号肽通过侧向门进入脂双层，被信号肽酶切除 4. 翻译继续，直到遇到一段疏水的停止转移序列（stop-transfer sequence） 5. 停止转移序列是一个约 20-25 个氨基酸的疏水区段，它停留在 Sec61 通道中，不再继续穿过 6. 停止转移序列通过侧向门横向移动到脂双层中，成为跨膜锚定区（transmembrane anchor） 7. 之后翻译的部分留在细胞质侧 8. 最终拓扑：N 端（在 ER 腔/细胞外）—— 跨膜区 —— C 端（在细胞质）

Type II 膜蛋白的合成过程（以转铁蛋白受体为例）：

1. 蛋白质没有 N 端可切割信号肽 2. 翻译开始后，一段内部的疏水序列从核糖体出口隧道冒出 3. 这段序列称为信号锚定序列（signal-anchor sequence），兼具信号肽和跨膜锚的功能 4. SRP 识别这段疏水序列，靶向 ER 膜 5. 关键：信号锚定序列的方向取决于其两侧的电荷分布 6. 对于 Type II：正电荷在信号锚序列的 N 端侧 → N 端留在细胞质侧（正电荷内侧规则） 7. 信号锚序列两端的"+" 侧留细胞质，"-" 侧穿过去 8. C 端部分穿过通道进入 ER 腔 9. 最终拓扑：N 端（细胞质）—— 跨膜区 —— C 端（ER 腔/细胞外）

Type III 膜蛋白（以细胞色素 P450 为例）：

• 与 Type II 的区别仅在于信号锚序列两侧的电荷分布相反
• 正电荷在信号锚序列的 C 端侧 → C 端留在细胞质侧
• 最终拓扑：N 端（ER 腔）—— 跨膜区 —— C 端（细胞质）

> 正电荷内侧规则（Positive-inside rule） 是膜蛋白拓扑学的核心原则。信号锚定序列两侧，含更多正电荷（Arg, Lys）的一端留在细胞质侧。改变电荷分布可以翻转膜蛋白的方向。这条规则也适用于细菌膜蛋白。

Type IV 多次跨膜蛋白的合成（以 GPCR 为例）：

多次跨膜蛋白有多个跨膜区域，它们交替作为起始转移信号和停止转移信号：

以一个 7 次跨膜的 GPCR 为例（Type IV-A，N 端在细胞质）：

1. 第一个疏水区段作为信号锚定序列（SA），插入 Sec61，N 端留在细胞质（正电荷内侧规则） 2. 翻译继续，多肽进入 ER 腔 3. 第二个疏水区段作为停止转移锚定序列（STA），停留在通道中，C 端侧回到细胞质 4. 第三个疏水区段又作为 SA，开始新一轮转运 5. 如此交替，直到所有跨膜区域都插入膜中

Type IV-B（N 端在 ER 腔）则是第一个 SA 的方向相反，使 N 端进入 ER 腔。

Sec61 通道的侧向门在这个过程中不断开合，每个跨膜区域都通过侧向门释放到脂双层中。

尾锚定蛋白（Tail-anchored proteins）的特殊进口机制：

TA 蛋白的跨膜区位于 C 端最后 ~20 个氨基酸。当翻译完成时，这段跨膜区还埋在核糖体内部，SRP 无法在翻译过程中识别到它。因此 TA 蛋白使用一条完全不同的途径——GET 途径：

GET 途径的步骤： 1. 捕获：TA 蛋白从核糖体释放后，其疏水 C 端暴露。预靶向复合物（由 Sgt2 + Get4 + Get5 组成）识别并保护疏水的跨膜区。 2. 转交：Sgt2 将 TA 蛋白转交给 Get3（一种 ATPase）。Get3 结合 ATP 后呈"关闭"构象，形成一个疏水凹槽，紧紧包裹 TA 蛋白的跨膜区。 3. 靶向：Get3-TA 蛋白复合物靶向 ER 膜上的受体 Get1-Get2。 4. 插入：Get3 水解 ATP，构象改变为"打开"态，释放 TA 蛋白，跨膜区插入 ER 膜。 5. 循环：Get3 回到细胞质，准备下一轮循环。

TA 蛋白的例子：

• SNARE 蛋白（如 VAMP/synaptobrevin、syntaxin）：囊泡融合的核心机器
• Bcl-2 家族蛋白：凋亡调控
• Sec61β：Sec61 转运通道的 β 亚基本身就是 TA 蛋白

GPI 锚定蛋白的生成（详述）：

GPI 锚定蛋白经历了一个独特的两步过程：

1. 第一步——作为跨膜蛋白合成：蛋白质含有 N 端信号肽和 C 端跨膜区/GPI 信号序列。它先作为 Type I 样膜蛋白插入 ER 膜。 2. 第二步——跨膜区替换为 GPI 锚：

• ER 腔内有一个预先合成好的 GPI 锚前体（glycosylphosphatidylinositol anchor），插在 ER 膜内叶
• GPI 转氨酶（GPI transamidase） 切除蛋白质的 C 端跨膜区/GPI 信号序列
• 同时将蛋白质的新 C 端与 GPI 锚通过酰胺键连接

GPI 锚的完整结构（从蛋白质到膜）：

蛋白质-C端 —— 磷酸乙醇胺（phosphoethanolamine）
              |
              甘露糖 — 甘露糖 — 甘露糖（3 mannose）
                                    |
                                    葡糖胺（glucosamine）
                                    |
                                    肌醇（inositol）
                                    |
                                    磷脂（嵌入膜外叶）

GPI 锚定蛋白的特点：

• 只在细胞表面的外叶
• 可以被 PI-PLC（磷脂酶 C） 切割释放
• 常存在于脂筏（lipid raft） 微域中
• 功能多样：酶、受体、粘附分子等

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第三部分：线粒体蛋白质进口

3.1 线粒体的结构详述

线粒体是"细胞的发电站"，有独特的双膜结构：

外膜（Outer Mitochondrial Membrane, OMM）：

• 含大量porin/VDAC（电压依赖性阴离子通道），使小分子（< ~5 kDa）可以自由通过
• 因此，膜间隙的小分子组成与细胞质相似
• 外膜相对简单，蛋白质含量较低

膜间隙（Intermembrane Space, IMS）：

• 小分子组成类似细胞质
• 含有多种功能蛋白：
• 细胞色素 c：电子传递链组分，凋亡时释放到细胞质触发 caspase 级联
• Mia40/Erv1：氧化折叠系统
• 各种激酶

内膜（Inner Mitochondrial Membrane, IMM）：

• 高度不透性：即使是 H⁺ 也不能自由通过（除了通过特异性载体/通道）
• 向内折叠形成嵴（cristae），极大地增加表面积
• 含有：
• 电子传递链复合物（Complex I-IV）
• ATP 合酶（Complex V）
• 各种代谢物载体蛋白（ADP/ATP 载体、磷酸载体等）
• 蛋白质导入通道（TIM23、TIM22、OXA）
• 磷脂组成特殊：含大量心磷脂（cardiolipin）（类似细菌膜，支持内共生起源）
• 蛋白质:脂质比例高达 3:1（细胞质膜约 1:1）

基质（Matrix）：

• 含：三羧酸循环酶、脂肪酸β-氧化酶、氨基酸代谢酶
• 线粒体 DNA（~16.5 kb 环形分子，编码 13 个蛋白质、22 个 tRNA、2 个 rRNA）
• 线粒体核糖体（mitoribosomes）：70S 类型（细菌样）
• 分子伴侣：mtHsp70、Hsp60/Hsp10
• 蛋白酶：MPP（加工前导序列）

3.2 线粒体前导序列（Pre-sequence）的详细特征

线粒体基质蛋白的 N 端前导序列与 ER 信号肽有本质区别：

两亲性α螺旋的示意：

如果将前导序列画成α螺旋，从端面看（helical wheel projection），你会看到：

• 一面全是疏水氨基酸（Leu, Ile, Val, Phe）
• 另一面全是带正电荷的氨基酸（Arg, Lys）和极性氨基酸

这种两亲性结构是被 TOM 受体（Tom20）识别的关键。Tom20 有一个疏水凹槽，可以结合前导序列的疏水面，而正电荷面暴露在外。

为什么线粒体前导序列富含精氨酸（Arg）而不是赖氨酸（Lys）？

这可能与识别特异性有关。Arg 的胍基有独特的氢键模式，可能有助于与 Tom20 受体的特异性识别，以及与内膜膜电位的相互作用。

3.3 线粒体蛋白转运机器（全面详解）

TOM 复合物（Translocase of the Outer Membrane）

TOM 是所有核编码线粒体蛋白进入线粒体的第一道关卡。

组成：

• Tom20：初级受体，识别前导序列的疏水面。Tom20 是一种外周膜蛋白，N 端锚定在外膜，C 端的 TPR（tetratricopeptide repeat）结构域伸向细胞质，暴露一个疏水凹槽。
• Tom22：二级受体（cis 受体），将前导序列从 Tom20 传递到 Tom40 通道。Tom22 在膜间隙侧也有结构域（trans 受体），帮助蛋白质穿过通道后的释放。
• Tom70：识别含内部靶向信号的前体蛋白（如载体蛋白类），通常与 Hsp70/Hsp90 协作。
• Tom40：核心通道亚基，形成β-barrel 结构（由β折叠片围成的桶状通道），约 22 Å 内径。每个 TOM 复合物含 2 个 Tom40 拷贝（即双通道）。
• Tom5, Tom6, Tom7：小 Tom 蛋白，调节通道的组装和稳定性。

SAM 复合物（Sorting and Assembly Machinery）

• 也称为 TOB（Topogenesis of Outer membrane β-barrel proteins）
• 功能：将β-barrel 蛋白正确折叠并插入外膜
• 核心亚基：Sam50（本身是β-barrel 蛋白）
• 工作路径：前体蛋白穿过 TOM → 在膜间隙由小 Tim 伴侣护送 → SAM 将其从膜间隙侧插入外膜
• 例子：VDAC/Porin、Tom40 本身

TIM23 复合物

TIM23 负责转运含有 N 端前导序列的蛋白质。

组成：

• Tim23：核心通道亚基，与 Tim17 形成通道
• Tim17：与 Tim23 共同形成转运通道
• Tim50：识别从 TOM 穿过来的前导序列（膜间隙侧受体）
• Tim21：连接 TIM23 与呼吸链复合物 III/IV
• PAM（Presequence translocase-Associated Motor）复合物：
• Tim44：将 mtHsp70 锚定到 TIM23 的基质侧出口
• mtHsp70（Ssc1 in yeast）：ATP 驱动的分子伴侣，拉动多肽进入基质
• Mge1：mtHsp70 的核苷酸交换因子（NEF），促进 ADP → ATP 交换
• Tim14/Pam18：mtHsp70 的 J 蛋白（co-chaperone），刺激 ATP 水解
• Tim16/Pam16：调节 Tim14

TIM22 复合物

TIM22 负责将多次跨膜的载体蛋白插入内膜。

靶向的蛋白质：

• ADP/ATP 载体（AAC/ANT）
• 磷酸载体
• 二羧酸载体
• Tim22 和 Tim23 本身

这些蛋白的特征是含有内部靶向信号（不是 N 端前导序列），由 4-6 个跨膜结构域组成。

进口路径： 1. 前体蛋白被细胞质 Hsp70/Hsp90 维持在可溶状态 2. Tom70 识别这些复合物 3. 穿过 TOM 通道 4. 在膜间隙，小 Tim 蛋白（Tim9-Tim10-Tim12 复合物）接力护送 5. 蛋白质被传递到 TIM22 6. 膜电位（Δψ）驱动跨膜区段插入内膜 7. 不需要 ATP 水解（与 TIM23 不同）

OXA 复合物（Oxidase Assembly machinery）

• OXA1（酵母中称为 Oxa1p）是核心亚基
• 属于 YidC/Oxa1/Alb3 蛋白家族（存在于所有生命域）
• 功能：从基质侧将蛋白质插入内膜
• 主要用于：
• 线粒体自身基因组编码的蛋白质（在基质中翻译后插入内膜）
• 某些核编码蛋白：先进入基质，再通过 OXA 插入内膜（"保守插入途径"）
• 例子：细胞色素氧化酶（Complex IV）的某些亚基

3.4 基质蛋白进口的驱动力（详述）

进口线粒体基质蛋白需要两种能量：

（1）内膜膜电位（Δψ，约 -180 mV，基质侧为负）

线粒体内膜维持着显著的质子电化学梯度（由呼吸链产生的质子泵维持）：

• 基质侧：H⁺ 浓度低（pH ~8）、负电位
• 膜间隙侧：H⁺ 浓度高（pH ~7）、正电位

前导序列富含正电荷（Arg, Lys），会被负电位电泳（electrophoresis）拉入基质。这类似于电场驱动带电粒子运动。

实验证据：

• 用解偶联剂（如 CCCP、valinomycin）消除膜电位 → 蛋白质进口立即停止
• 恢复膜电位 → 进口恢复

膜电位主要驱动前导序列穿过内膜，是进口的早期步骤。

（2）ATP 水解（mtHsp70 驱动的棘轮机制）

基质中的 mtHsp70 消耗 ATP 拉动蛋白质的后续部分进入基质。

详细机制： 1. 前导序列穿过 TIM23 后，被基质中的 Tim44 捕获 2. Tim44 将 mtHsp70-ATP 招募到通道出口 3. mtHsp70 结合露出基质的多肽段 4. Tim14（J 蛋白）刺激 mtHsp70 的 ATP 水解活性 5. mtHsp70-ADP 紧紧"夹住"多肽（类似"老虎钳"），蛋白质不能回退 6. Mge1（NEF）促进 ADP → ATP 交换，mtHsp70 释放多肽 7. 下一个 mtHsp70 分子结合更前方的多肽段 8. 重复步骤 3-7，蛋白质被逐步拉入基质

最终，进入基质的蛋白质：

• 前导序列被 MPP（Mitochondrial Processing Peptidase） 切除
• 在 Hsp60/Hsp10 chaperonin 系统帮助下正确折叠

3.5 线粒体内膜和膜间隙蛋白的进口（五种途径详解）

途径 1：TOM → TIM23 侧向释放到内膜

适用于：含 N 端前导序列 + 一个疏水停止转移序列的内膜蛋白

过程： 1. 前导序列被膜电位驱动穿过 TOM 和 TIM23 2. 前导序列在基质被 MPP 切除 3. 后续的疏水停止转移序列到达 TIM23 通道时，不再继续穿过 4. TIM23 的侧向门打开，将疏水区域释放到内膜脂双层中 5. 蛋白质锚定在内膜上：N 端域在基质，C 端域在膜间隙

TIM23 复合物存在两种形态：

• TIM23-PAM（含 mtHsp70 马达）：用于完全转运到基质
• TIM23-SORT（与 Tim21 和呼吸链结合）：用于侧向释放到内膜

途径 2：TOM → TIM23 → 基质 → OXA 插入内膜（保守插入途径）

适用于：某些内膜蛋白，含前导序列 + 第二信号序列

过程： 1. 蛋白质完全进入基质（通过 TOM + TIM23） 2. 前导序列被 MPP 切除 3. 第二信号序列（内部疏水区段）被 OXA 复合物识别 4. OXA 将蛋白质从基质侧"推"入内膜

为什么叫"保守"插入途径？因为这与细菌中 YidC 将新合成蛋白插入质膜的途径同源——反映了线粒体的细菌起源。

途径 3：经过两次蛋白酶切割进入膜间隙

适用于：某些膜间隙蛋白

过程： 1. 蛋白质含有前导序列 + 紧随其后的疏水序列 2. 前导序列穿过 TOM 和 TIM23 进入基质 3. 疏水序列作为停止转移信号，锚定在内膜中 4. 第一次切割：基质中的 MPP 切除前导序列 5. 第二次切割：膜间隙侧的蛋白酶切除锚定区 6. 切割后的蛋白质被释放到膜间隙中

途径 4：TOM → Mia40 氧化折叠捕获（MIA 途径）

适用于：小的膜间隙蛋白，含 CX₃C 或 CX₉C 基序

这些蛋白通常是 ~10 kDa 的小蛋白，以还原（未折叠）状态穿过 TOM 通道。它们没有 N 端前导序列。

过程： 1. 还原态蛋白（-SH 自由基）穿过 TOM 通道进入膜间隙 2. 膜间隙中的氧化还原酶 Mia40（Mitochondrial Intermembrane space Import and Assembly protein）识别蛋白质 3. Mia40 将自己的二硫键（-S-S-）转移给底物蛋白，使底物形成分子内二硫键 4. 折叠后的蛋白质太大，无法再穿回 TOM 通道 → 被"锁"在膜间隙中 5. Mia40 变为还原态后，被 Erv1（一种巯基氧化酶）再氧化 6. Erv1 将电子最终传递给呼吸链（通过细胞色素 c → 复合物 IV → O₂）

这个机制非常精巧——利用蛋白质折叠本身作为"单向阀"，确保蛋白质只能进不能出。

途径 5：TOM → 小 Tim → TIM22 多次跨膜蛋白插入内膜

适用于：代谢物载体蛋白家族（MCF，Mitochondrial Carrier Family）

过程： 1. 前体蛋白在细胞质中被 Hsp70/Hsp90 维持可溶 2. Tom70 受体识别 Hsp-前体复合物 3. 前体穿过 TOM 通道 4. 在膜间隙中，小 Tim 伴侣（Tim9-Tim10 六聚体环）包裹住前体的疏水跨膜区段 5. 小 Tim 将前体传递到 TIM22 复合物 6. 膜电位（Δψ）驱动跨膜区段插入内膜（不需要 ATP） 7. 蛋白质在内膜中获得最终的折叠构象

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第四部分：过氧化物酶体蛋白质进口

4.1 过氧化物酶体的形态和功能（扩展版）

形态：

• 单层膜包被的球形细胞器
• 直径 0.1-1 μm
• 每个细胞含数百到上千个（肝细胞和肾细胞中特别丰富）
• 在电子显微镜下，某些物种的过氧化物酶体含有结晶核心（paracrystalline core），由大量堆积的酶（如尿酸氧化酶 urate oxidase）构成

核心代谢功能：

（1）H₂O₂ 代谢

过氧化物酶体因其利用 H₂O₂ 的反应而得名：

• 氧化酶（如氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶、脂酰-CoA 氧化酶）消耗 O₂，产生 H₂O₂：
• RH₂ + O₂ → R + H₂O₂
• 过氧化物酶反应（peroxidation）：利用 H₂O₂ 氧化有害底物：
• H₂O₂ + R'H₂ → R' + 2H₂O
• 底物包括苯酚、甲醛、甲酸、乙醇（肝脏中！喝酒后，肝脏过氧化物酶体利用此反应氧化部分乙醇）
• 过氧化氢酶（catalase） 分解过量 H₂O₂：
• 2H₂O₂ → O₂ + 2H₂O
• Catalase 是过氧化物酶体含量最丰富的酶之一

> 有趣的是，catalase 可以在分解 H₂O₂（catalatic activity）和利用 H₂O₂ 氧化底物（peroxidatic activity）之间切换，取决于 H₂O₂ 浓度。

（2）脂肪酸β-氧化

过氧化物酶体和线粒体都能进行脂肪酸β-氧化，但分工不同：

• 过氧化物酶体：氧化超长链脂肪酸（>C22）和支链脂肪酸。过氧化物酶体中的第一步氧化反应由酰基-CoA 氧化酶催化，电子直接传给 O₂ 产生 H₂O₂（不产生 ATP）。
• 线粒体：氧化短链和中链脂肪酸，产生 FADH₂ 和 NADH → ATP。

过氧化物酶体将超长链脂肪酸缩短后（至 C8 左右），产物转运到线粒体继续完全氧化。

（3）缩醛磷脂（plasmalogen）合成

过氧化物酶体催化缩醛磷脂合成的前两步反应。缩醛磷脂是一类特殊的磷脂，在 sn-1 位通过乙烯基醚键（vinyl ether bond，而非酯键）与脂肪酸链连接。

缩醛磷脂占大脑磷脂的约 20%，是髓鞘（myelin sheath）的重要组分。髓鞘是包裹神经轴突的绝缘层，对于神经信号的快速传导至关重要。

> 临床意义：Zellweger 综合征患者由于 PEX 基因突变导致过氧化物酶体无法正确组装，缺乏缩醛磷脂合成和超长链脂肪酸氧化能力，表现为严重的神经发育障碍、肝脏和肾脏功能异常，通常在出生后数月内死亡。

（4）其他功能

• 胆汁酸合成（侧链氧化）
• 乙醛酸循环（植物过氧化物酶体，又称乙醛酸体 glyoxysome）
• 嘌呤分解（某些物种）
• 光呼吸（植物）

4.2 过氧化物酶体蛋白进口的特殊机制（详述）

过氧化物酶体的蛋白质进口系统与 ER 和线粒体有根本不同：

独特特征： 1. 蛋白质以折叠态进口：与 ER（需解折叠或边翻译边转运）和线粒体（需解折叠穿过窄通道）不同 2. 甚至可以进口寡聚体：已组装的多亚基复合物可以整体被进口 3. 进口通道是瞬时组装的：不像 Sec61 或 TOM/TIM 那样永久存在于膜上

两种过氧化物酶体靶向信号：

PTS1（Peroxisomal Targeting Signal 1）：

• 位于蛋白质的 C 端最后 3 个氨基酸
• 经典三肽：-SKL（Ser-Lys-Leu）
• 变体也可以：-SRL、-AKL、-SQL 等（共识是小/正电荷/疏水）
• 大约 95% 的过氧化物酶体基质蛋白使用 PTS1
• 被胞质受体 Pex5 识别

PTS2：

• 位于蛋白质 N 端附近
• 共识序列：-R/K-L/V/I-X₅-H/Q-L/A-（约 9 个氨基酸）
• 只有少数蛋白使用
• 被胞质受体 Pex7 识别
• 在某些物种（哺乳动物）中，PTS2 在进口后被切除

Pex5 的"穿梭受体"机制（Cycling receptor model）：

1. 识别：胞质中的 Pex5 识别并结合含 PTS1 的货物蛋白 2. 对接：Pex5-货物复合物与过氧化物酶体膜上的对接复合物（Pex14 + Pex13）结合 3. 转位：Pex5 连同货物一起部分或完全插入膜中（甚至可能进入过氧化物酶体腔内）。这是一个争议话题——Pex5 本身可能作为临时转运通道的一部分。 4. 释放：货物在过氧化物酶体腔内释放 5. 回收：Pex5 被单泛素化（与 Pex4 泛素连接酶相关）后，被 Pex1-Pex6 AAA-ATPase从膜中拉出，回到胞质中去泛素化后重新使用

> 如果 Pex5 的回收失败（如 Pex1 或 Pex6 突变），Pex5 被多泛素化并送去蛋白酶体降解。这会导致过氧化物酶体进口功能丧失——这正是某些 Zellweger 综合征变体的分子基础。

4.3 过氧化物酶体的起源（详述）

过氧化物酶体的起源有两条途径，目前认为两者共存：

途径 1：从 ER 从头生成（de novo biogenesis）

1. 过氧化物酶体膜蛋白（如 Pex3、Pex16）首先在 ER 中合成 2. 它们从 ER 芽出到前过氧化物酶体囊泡（pre-peroxisomal vesicles） 3. Pex19（胞质伴侣/受体）识别并护送其他膜蛋白到这些前体囊泡 4. 多个前体囊泡融合形成新的过氧化物酶体 5. 新的过氧化物酶体通过从胞质进口基质蛋白来成熟

途径 2：生长和分裂

1. 已存在的过氧化物酶体持续从胞质进口蛋白质和脂质 2. 过氧化物酶体体积增大 3. 通过 Pex11（膜变形蛋白）和 DRP（dynamin-related protein，如 Dnm1/Drp1） 介导的分裂（fission），产生子代过氧化物酶体

正常情况下，途径 2 是维持过氧化物酶体数量的主要方式。途径 1 可能在过氧化物酶体完全缺失时（如 Zellweger 综合征的某些基因型被遗传互补后）启动从头合成。

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第五部分：核蛋白的进口与出口

5.1 核质运输概述

细胞核是真核细胞中唯一使用门控运输的细胞器。核膜将遗传物质与细胞质分隔，但基因表达需要持续的核-质交流：

进口核内的分子及其功能意义：

• 组蛋白（H2A, H2B, H3, H4, H1）：DNA 复制时大量需要，用于新染色质组装。组蛋白是碱性蛋白（富含 Lys 和 Arg），本身就含有类 NLS 序列。
• DNA 聚合酶、DNA 连接酶、拓扑异构酶：DNA 复制和修复
• RNA 聚合酶 I/II/III：转录
• 转录因子：基因调控。许多转录因子的核进口是基因激活的关键调控步骤。
• RNA 剪接因子（snRNPs 等）：mRNA 前体加工
• 核糖体蛋白：在核仁中与 rRNA 组装成核糖体亚基前体

从核内出口的分子：

• mRNA（以 mRNP 形式）：成熟 mRNA 与多种蛋白质结合后出核
• tRNA：在核内加工成熟后出口
• 核糖体亚基前体（40S 和 60S pre-subunits）：在核仁组装后出核，在细胞质中完成最终成熟
• 某些蛋白质：如用过的 snRNP 蛋白需要回到细胞质

运输的规模和速度：

一个典型的增殖中的哺乳动物细胞，每分钟需要：

• 进口约 100 万个组蛋白分子
• 出口约 3 条新合成的核糖体亚基前体每秒
• 出口数千条 mRNA 分子

NPC 的运输速率可达 ~1000 个大分子/秒/NPC，考虑到每个细胞有 3000-4000 个 NPC，总通量极其可观。

5.2 核孔复合体（NPC）详解

NPC 是已知最大的蛋白质复合物之一：

NPC 的分层结构：

从细胞质到核内，NPC 可以分为以下几层：

（1）胞质纤维（Cytoplasmic filaments）

• 约 8 条纤维从 NPC 的细胞质面向外伸出，长约 50 nm
• 由 Nup358/RanBP2 构成
• 功能：初步捕获从细胞质靠近的 Importin-货物复合物
• Nup358 含有 FG 重复序列和 Ran 结合位点

（2）细胞质环（Cytoplasmic ring）

• 由 Y-复合物（Nup107-160 复合物）组成的外环
• 八重旋转对称

（3）中心通道（Central channel）

• 由 FG-核孔蛋白（FG-Nups） 的无序 FG 重复结构域填充
• FG 重复序列呈本征无序蛋白（intrinsically disordered protein）状态
• 形成选择性通透屏障

（4）核质环（Nuclear ring）

• 另一组 Y-复合物

（5）核篮（Nuclear basket）

• 8 条纤维从核面伸出，在末端汇合形成篮状结构
• 由 Nup153（含大量 FG 重复）和 TPR 蛋白组成
• 功能：mRNA 出口质量控制的检查站

FG 重复序列——选择性屏障的核心：

FG-Nups 含有数十到数百个苯丙氨酸-甘氨酸（FG）重复序列，以不同间距排列（如 FG、FXFG、GLFG）。

这些 FG 重复形成了 NPC 的选择性通透屏障。目前有几种模型解释其工作原理：

• 选择性相分离模型（Selective phase model）：FG 重复之间的疏水相互作用形成一种"凝胶"相，排斥没有核转运受体的大分子。核转运受体（importin/exportin）表面有多个疏水口袋，可以与 FG 重复相互作用，从而"溶解"到这个凝胶中，携带货物穿过。
• 虚拟门控模型（Virtual gate model）：FG 重复快速运动产生"熵屏障"，大分子被排斥。核转运受体通过与 FG 重复的相互作用克服这个屏障。
• 林状纤维模型（Forest model）：FG 重复形成不同高度和密度的"树林"，只有与 FG 重复亲和的受体才能穿越。

无论哪种模型，核心原则是一致的：核转运受体通过与 FG 重复的疏水相互作用穿越 NPC，而不携带受体的大分子被排斥。

5.3 核定位信号（NLS）的详细分析

经典 NLS（cNLS）的两种类型：

（1）单部分 NLS（Monopartite NLS）

由一段连续的碱性氨基酸组成：

• 经典例子：SV40 大 T 抗原的 NLS：-PKKKRKV-
• 特征：4-8 个碱性氨基酸（Lys/Arg）的簇

SV40 T 抗原 NLS 的实验验证（详述）：

实验 1——突变分析：

• 野生型 NLS：-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-
• 突变型（K128T）：-Pro-Pro-Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Val-
• 结果：仅一个氨基酸的改变就完全阻断了核进口
• 意义：证明了序列的特异性，不是简单的正电荷效应

实验 2——融合蛋白实验（pyruvate kinase 实验）：

• 丙酮酸激酶（~60 kDa）正常在细胞质中
• 将 SV40 NLS 融合到丙酮酸激酶上
• 用荧光显微镜观察定位
• 正常丙酮酸激酶：弥散分布在细胞质中（核内也有少量，因为 <60 kDa 可以一定程度被动扩散入核）
• NLS-丙酮酸激酶：高度集中在细胞核中（远超被动扩散水平）
• 意义：NLS 是充分条件——将任何胞质蛋白融合 NLS 就能使其进入细胞核

（2）双部分 NLS（Bipartite NLS）

由两簇碱性氨基酸组成，中间由约 10 个氨基酸的连接区隔开：

• 经典例子：nucleoplasmin 的 NLS：-KR-PAATKKAGQA-KKKK-
• 两个碱性簇分别与 Importin-α 的两个 NLS 结合位点相互作用

非经典 NLS：

并非所有 NLS 都是碱性氨基酸簇。某些蛋白质使用非经典 NLS：

• PY-NLS：含有保守的 R/K/H-X(2-5)-PY 基序，被 Importin-β2/Transportin 直接识别
• 信号斑（Signal patch）：在三维结构表面形成的 NLS，只有折叠后才存在

NLS 的关键特性总结：

• 富含 Lys 和/或 Arg
• 可以位于蛋白质的任何位置（N 端、C 端、中间）
• 不被切除（与 ER 信号肽和线粒体前导序列不同）
• 一个蛋白质可以同时含有 NLS 和 NES（决定其稳态分布）

5.4 核进口受体系统（详述）

Importin 超家族（Karyopherin-β 家族）：

哺乳动物中有约 20 种 karyopherin-β 家族成员，包括进口受体和出口受体。它们的共同特征是：

• 含有约 20 个 HEAT 重复序列（Huntingtin, Elongation factor 3, PR65/A, TOR）
• HEAT 重复形成超螺旋结构，呈"弹簧"状
• 可以与 FG-Nup 的 FG 重复相互作用
• 可以与 Ran-GTP 结合（Ran 结合改变其构象，控制货物的结合/释放）

经典核进口途径（Importin-α/β 途径）：

这是最早被阐明、最经典的核进口途径：

组分：

• Importin-α：适配蛋白（adaptor），N 端有自抑制的 IBB 域（Importin-β binding domain），中间有 ARM 重复（Armadillo repeat），形成凹槽识别经典 NLS
• Importin-β：转运受体，与 Importin-α 的 IBB 域结合，与 FG-Nup 相互作用

步骤： 1. 货物识别（细胞质）：Importin-α 的 ARM 结构域识别货物蛋白的 NLS。同时，Importin-β 结合 Importin-α 的 IBB 域，形成三元复合物：Importin-β : Importin-α : 货物 2. 穿越 NPC：Importin-β 与 FG-Nup 的 FG 重复反复结合-解离，携带整个复合物穿过中心通道 3. 核内释放（核内）：核内高浓度的 Ran-GTP 与 Importin-β 结合 → Importin-β 构象改变 → 释放 Importin-α → Importin-α 的 IBB 域自身折叠回来，竞争性地将 NLS 货物从 ARM 结构域挤出 → 货物被释放到核内 4. 受体回收：

• Importin-β-Ran-GTP 复合物回到细胞质。在细胞质，RanGAP + RanBP1 促进 Ran 水解 GTP → GDP。Ran-GDP 释放 Importin-β，Importin-β 回到可用状态。
• Importin-α 由出口受体 CAS/CSE1L 携带 Ran-GTP 从核内运出细胞质。在细胞质，Ran-GTP 水解后，CAS 释放 Importin-α。
• Ran-GDP 通过 NTF2（Nuclear Transport Factor 2）被运回核内。在核内，RCC1（RanGEF）催化 GDP → GTP 交换，维持核内 Ran-GTP 高浓度。

直接 Importin-β 途径：

某些货物蛋白不需要 Importin-α 适配蛋白，直接被 Importin-β 家族成员识别：

• Importin-β1 可以直接识别某些含 IBB-like 域的蛋白
• Importin-β2/Transportin 识别含 PY-NLS 的蛋白
• Importin-7 识别组蛋白 H1
• Importin-4 识别组蛋白 H3-H4

5.5 核出口系统（详述）

核出口信号（NES）：

• 典型的 NES 是富含亮氨酸的序列
• 共识模式：Φ-X(2-3)-Φ-X(2-3)-Φ-X-Φ（Φ = 疏水氨基酸，通常是 Leu, Ile, Val, Phe, Met）
• 例如：HIV Rev 蛋白的 NES：-LPPLERLTL-
• NES 比 NLS 更难预测，因为很多蛋白质内部都有疏水氨基酸簇

CRM1/Exportin 1——主要的蛋白质出口受体：

CRM1 是最重要的蛋白质出口受体，识别富含 Leu 的 NES。

出口三元复合物的形成（在核内）： 1. 核内 Ran-GTP 浓度高 2. Ran-GTP 首先与 CRM1 结合 → CRM1 构象改变 3. 构象改变后的 CRM1 现在可以识别并结合 NES 货物 4. 形成三元复合物：CRM1 : Ran-GTP : NES-货物

出口后（在细胞质）： 1. RanGAP + RanBP1 促进 Ran 水解 GTP 2. Ran-GDP 不再能稳定 CRM1 的"货物结合"构象 3. CRM1 释放货物到细胞质 4. CRM1 回到核内准备下一轮出口

> 药物工具：Leptomycin B（LMB） 是 CRM1 的特异性抑制剂，通过共价修饰 CRM1 的 Cys528 来阻断 NES 识别。LMB 可以阻断几乎所有 CRM1 介导的核出口，是研究核出口的重要工具。

mRNA 出口——一条不同的途径：

值得注意的是，mRNA 的出口不使用 CRM1 途径，而是使用专门的 Mex67-Mtr2（酵母）/ NXF1-NXT1（哺乳动物）途径。mRNA 出口与 mRNA 加工（剪接、多聚腺苷酸化）紧密偶联，只有正确加工的 mRNA 才被允许出口——这是基因表达的重要质量控制步骤。

5.6 Ran GTPase 循环的全面解析

Ran 循环是理解核运输方向性的核心。让我们从最基本的原理出发：

Ran 的基本数据：

• Ran 是 Ras 超家族的小 GTPase（~25 kDa）
• 是细胞中最丰富的 GTP 结合蛋白之一
• 大部分 Ran（~80%）位于核内

Ran 梯度的建立：

为什么 RCC1 在核内？

RCC1 直接结合核小体（nucleosome），因此被锚定在染色质上。只要 DNA 在核内，RCC1 就在核内 → Ran-GTP 就在核内产生。这个简单的定位原则建立了整个 Ran 梯度。

Ran 梯度如何决定运输方向——统一原则：

本质上，Ran-GTP 对 Importin 和 Exportin 的作用完全相反：

• 对 Importin：Ran-GTP 引起释放货物
• 对 Exportin：Ran-GTP 促进结合货物

这保证了进口货物在核内被释放，出口货物在细胞质被释放——方向性由此建立。

每次运输循环消耗多少能量？

每次 Importin 或 Exportin 的一个往返循环：

• 消耗 1 个 GTP（Ran-GTP → Ran-GDP）
• 还需要 1 个 GTP 来将 Ran-GDP 重新激活为 Ran-GTP（通过 NTF2 运回核内 + RCC1 催化交换）
• GTP 的再生需要 ATP（NDP kinase 催化：ATP + GDP → ADP + GTP）

所以，核运输本质上是消耗 ATP 驱动的过程。

5.7 NF-AT 核质穿梭的调控（全面解析）

NF-AT（Nuclear Factor of Activated T cells）家族蛋白是研究核质穿梭调控的最佳模型之一。让我们详细分析每一步。

NF-AT 的结构域组成：

N端 ─[ C1 ][ C2 ]─[ A ]─[ Z ]──────[ Rel Homology Domain (RHD) ]── C端
     └─────┘              └──┘       └──────── NLS ────────────┘
     Calcineurin     NLS masking     DNA 结合域
     结合位点         domain (磷酸化位点)
                    
     另外：CKIα 结合位点位于 N 端区域

关键结构域功能：

• C1/C2 域：Calcineurin（钙调磷酸酶）的结合位点。Calcineurin 必须结合到这里才能去磷酸化 NF-AT。
• A 域 + Z 域：含有被磷酸化的丝氨酸残基。磷酸化时，这个区域的构象遮盖（mask）NLS，同时暴露 NES。去磷酸化时，NLS 暴露，NES 被遮盖。
• RHD（Rel Homology Domain）：DNA 结合域，与 NF-κB 家族有结构相似性。含有 NLS。
• CKIα 结合位点：CKI（Casein Kinase I）结合并在核内重新磷酸化 NF-AT。

静息状态下的 T 细胞（低 Ca²⁺）：

1. NF-AT 被多种激酶磷酸化：

2. 磷酸化导致：

3. 稳态结果：NF-AT 主要位于细胞质

• CKI（Casein Kinase I）：在核内和细胞质中都有活性
• GSK3（Glycogen Synthase Kinase 3）：在细胞质中磷酸化
• DYRK1/2：磷酸化引发（priming）位点
• NLS masking domain 折叠回来覆盖 RHD 中的 NLS → Importin 无法识别
• NES 暴露 → CRM1 可以识别

T 细胞受体（TCR）激活后：

1. TCR 结合抗原-MHC 复合物 2. 激活 PLCγ → 产生 IP₃ 3. IP₃ → ER 释放 Ca²⁺ → 胞质 Ca²⁺ 升高 4. Ca²⁺ 与 钙调蛋白（calmodulin） 结合 5. Ca²⁺/calmodulin 激活 Calcineurin（钙调磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶） 6. Calcineurin 结合 NF-AT 的 C1/C2 域 7. Calcineurin 去磷酸化 NF-AT 的多个磷酸化位点 8. 去磷酸化导致：

9. NF-AT 快速进入细胞核

• NLS masking domain 构象改变 → NLS 暴露 → Importin-α/β 识别
• NES 被遮盖 → CRM1 无法识别

NF-AT 在核内的命运：

进入核内后： 1. NF-AT 与 DNA 上的 NFAT 结合位点结合 2. 通常与 AP-1（Fos/Jun）形成复合物，共同激活靶基因 3. 靶基因包括：IL-2（T 细胞增殖的关键细胞因子）、IL-4、TNF-α、IFN-γ 等 4. 同时，核内的激酶（CKIα、GSK3 等）持续磷酸化 NF-AT 5. 只要 Calcineurin 活性存在（Ca²⁺ 持续升高），去磷酸化速率 > 磷酸化速率 → NF-AT 留在核内 6. 一旦 Ca²⁺ 信号消失 → Calcineurin 失活 → 磷酸化速率 > 去磷酸化速率 → NLS 被遮盖、NES 暴露 → CRM1 介导快速出核

> 关键概念：NF-AT 的核出口是组成性的（constitutive）——CRM1 始终可以将暴露 NES 的 NF-AT 运出核。NF-AT 的核积累完全依赖于持续的 Ca²⁺/Calcineurin 信号来维持去磷酸化状态。这使得 NF-AT 成为 Ca²⁺ 信号的忠实传感器——信号在，NF-AT 在核内；信号消失，NF-AT 立即出核。

动态成像实验：

用 GFP-NF-AT4 融合蛋白的实时成像清楚展示了这种动态穿梭：

• 刺激 T 细胞（Ca²⁺ 升高）：GFP 荧光在 ~8 分钟内从细胞质转移到核内（Import）
• 去除刺激（Ca²⁺ 降低）：GFP 荧光在 ~20 分钟内回到细胞质（Export）
• 再次刺激：可以再次快速入核（Re-import）

免疫抑制药物的作用机制：

两种最重要的移植免疫抑制剂都通过阻断 Calcineurin 来抑制 NF-AT 的核进口：

环孢素 A（Cyclosporin A, CsA）：

• 来源：真菌代谢产物
• 机制：CsA 与亲环蛋白（cyclophilin）结合 → CsA-cyclophilin 复合物抑制 Calcineurin → NF-AT 不能去磷酸化 → 不能入核 → T 细胞不能激活 → 免疫抑制

FK506/他克莫司（Tacrolimus）：

• 来源：链霉菌代谢产物
• 机制：FK506 与 FKBP12 结合 → FK506-FKBP12 复合物抑制 Calcineurin → 同样的下游效应
• 药效比 CsA 更强（约 100 倍）

这两种药物是器官移植后防止排斥反应的基石药物，每年挽救成千上万的生命。它们的发现也反向验证了 NF-AT/Calcineurin 途径在 T 细胞激活中的核心地位。

5.8 Digitonin 透化实验——鉴定核运输因子的经典方法（详述）

这个实验体系的建立是核运输领域的里程碑，值得详细理解。

Digitonin 的选择性透化原理：

Digitonin 是一种甾体皂苷（steroid saponin），从毛地黄植物中提取。它的关键化学特性是：

• 与胆固醇（cholesterol）有高亲和力
• 在低浓度下，digitonin 与质膜中的胆固醇相互作用，在膜上形成孔洞，使质膜变得可透性
• 核膜的胆固醇含量远低于质膜，因此在同样浓度的 digitonin 下，核膜不受影响

不同膜的胆固醇含量：

• 质膜：~30-40%（占膜脂的比例）→ 容易被 digitonin 透化
• ER 膜：~5%
• 线粒体内膜：<5%
• 核膜：~10% → 在适当的 digitonin 浓度下不受影响

实验流程：

1. 将培养的细胞（如 HeLa 细胞或 BHK 细胞）用低浓度（~40-50 μg/ml）digitonin 处理 ~5 分钟 2. 质膜被透化 → 细胞质内容物（包括可溶性蛋白、核糖体、小分子等）流出 3. 洗涤去除 digitonin 和溢出的细胞质 4. 现在的细胞：质膜有孔（可进入），核膜和 NPC 完好 5. 加入以下成分：

6. 用荧光显微镜观察核内荧光积累

• 荧光标记的 NLS-蛋白（如 fluorescein-BSA-NLS）作为报告分子
• 测试不同条件：
• 仅加报告分子（无胞质因子）
• 加报告分子 + 胞质提取物
• 加报告分子 + 纯化的 Importin-α + Importin-β + Ran-GTP + NTF2 + ATP

结果：

这个实验体系还被用来进一步鉴定了：

• Importin-α 和 Importin-β 的各自角色
• Ran 的 GTP/GDP 循环
• NTF2 的功能
• CAS 作为 Importin-α 出口受体的角色

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总结与综合对比

各运输途径的全面对比

三种运输机制的核心逻辑

1. 门控运输（核运输）：蛋白质保持折叠态，通过巨大的 NPC（~40 nm 通道），由 Importin/Exportin 识别信号并穿越 FG 屏障。方向性由 Ran-GTP 梯度控制。

2. 跨膜运输（ER、线粒体等）：蛋白质必须解折叠（大多数情况），通过膜上的蛋白质通道（~1-2 nm 内径）穿过脂双层。方向性由信号序列被受体识别 + 膜另一侧的"拉力"（分子伴侣或膜电位）驱动。

3. 囊泡运输（分泌途径）：蛋白质始终在膜内（腔内或嵌在膜中），通过膜泡的出芽和融合在细胞器之间传递。方向性由被膜蛋白（coat proteins）、SNARE 和 Rab GTPase 控制。

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本讲义基于 SUSTech 邓怿教授 Lecture 11 课件整理并大幅扩展，参考教材：Molecular Biology of the Cell (Alberts et al., 7th Ed)、Molecular Cell Biology (Lodish et al., 9th Ed)、Essential Cell Biology (Alberts et al.)。适合零基础到进阶学习使用。