肿瘤 × scRNA-seq 一般是为了解决什么问题？¶

scRNA-seq 的核心价值是把“肿瘤样本平均值”拆成细胞组成、细胞状态和细胞间生态。

先把词听懂¶

单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）：对单个细胞测 mRNA，得到 cell × gene 矩阵。
肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）：肿瘤细胞之外的免疫、间质、血管和基质成分。
肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）：TME 中与免疫细胞和免疫抑制相关的部分。
肿瘤异质性（tumor heterogeneity）：不同肿瘤细胞克隆或状态之间的差异。
耐药细胞状态（drug-tolerant state）：治疗压力下暂时存活、可进一步演化成稳定耐药的细胞状态。

长答案¶

肿瘤 bulk RNA-seq 的一个根本限制是“平均”。一个样本里同时有肿瘤细胞、T 细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞，bulk 看到的上调可能来自细胞组成变化，也可能来自每个细胞内表达增强。

scRNA-seq 把问题拆开：

flowchart LR
  Tissue["肿瘤组织"] --> Cells["单细胞悬液"]
  Cells --> Matrix["cell × gene 矩阵"]
  Matrix --> Comp["细胞组成<br/>谁多谁少"]
  Matrix --> State["细胞状态<br/>谁被激活/耗竭/应激"]
  Matrix --> Tumor["肿瘤内异质性<br/>CNV/恶性细胞状态"]
  Matrix --> Immune["免疫生态<br/>TAM/Treg/CD8/DC"]
  Matrix --> Hyp["机制假设<br/>耐药/免疫逃逸/转移"]

肿瘤 scRNA-seq 常回答四类问题：

TIME 解析：哪些免疫细胞在场，它们是激活、耗竭还是抑制。
肿瘤异质性：恶性细胞里是否有不同状态或亚克隆。
治疗前后耐药机制：治疗压力是否选择出某些细胞状态。
罕见亚群发现：少量干性、EMT、药物耐受或抗原呈递缺陷细胞。

为什么这么设计 / 为什么临床会这样问¶

医生问“为什么这个病人不响应免疫治疗”，可能有三种完全不同的生物学答案：

没有足够 T 细胞进入肿瘤：immune excluded / desert。
T 细胞在场但功能耗竭：PDCD1、LAG3、TIGIT 等抑制轴。
肿瘤细胞本身不可见：抗原呈递缺陷、HLA 丢失、IFN 通路异常。

scRNA-seq 的优势是能把这些细胞状态分开。但它不能告诉你空间接触关系，也很难直接证明细胞通讯因果。因此医生如果关心“CD8 T 是否接触肿瘤细胞、TLS 是否靠近响应区域”，spatial 往往要加入。

取样策略¶

临床问题	推荐取样	关键注意
原发耐药	治疗前 biopsy，响应者 vs 不响应者	分期、治疗线数、驱动突变要匹配
获得性耐药	baseline + progression 配对	进展定义要清楚，最好配 ctDNA/WES
新辅助治疗反应	治疗前 + 手术残留	手术样本受治疗影响，细胞死亡和应激多
TIME 描述	新鲜组织优先	消化偏倚会丢失脆弱细胞和空间信息
罕见亚群	多样本、足够细胞量	批次和 doublet 会制造假罕见群

分析特殊性¶

肿瘤 scRNA-seq 不是普通组织 atlas。至少要处理：

恶性细胞识别：常用 inferred CNV、已知 marker、突变信息联合判断。
样本层 pseudobulk：避免把细胞数当生物重复。
dissociation stress：组织消化引起 FOS/JUN/HSP 等应激表达。
doublet：肿瘤细胞和免疫细胞 doublet 会伪造“细胞通讯”。
patient effect：病人差异常大于细胞状态差异。

常见陷阱¶

陷阱 1：把 cluster 自动命名成新细胞类型。
肿瘤中很多 cluster 只是状态、细胞周期、应激或样本来源。

陷阱 2：用细胞数当样本量。
10 个病人每人 5000 个细胞，生物重复仍然主要是 10，不是 50000。

陷阱 3：只做 ligand-receptor 图就讲通讯机制。
配体受体共表达只是线索，需要空间邻近、扰动实验或蛋白验证支撑。

客户对话切入¶

医生说这些话时，可以考虑肿瘤 scRNA-seq：

“我们想知道免疫治疗不响应是 T 细胞问题还是肿瘤细胞问题。”
“治疗后残留病灶里到底剩了什么细胞。”
“这个癌种病理很异质，bulk 看不清。”
“我们怀疑有一小群耐药细胞。”

医生说这些话时，要主动提醒 spatial 或 WES/WGS：

“我们关心肿瘤边界和免疫细胞接触。”
“我们想看克隆演化和驱动突变。”
“样本只有 FFPE，没有新鲜组织。”

里程碑论文入口¶

Tirosh et al. (2016), Science — 黑色素瘤单细胞揭示恶性细胞状态和 TME 异质性。
Azizi et al. (2018), Cell — 乳腺癌免疫微环境单细胞图谱。
Maynard et al. (2020), Cell — 肺癌靶向治疗残留和耐药相关状态。

后续应按文献深读模板逐篇拆 Figure，尤其是恶性细胞识别、细胞状态命名和治疗前后比较。

横向连接¶

[[medical-bridge/L1-clinical-literacy/pico-clinical-question]]
[[medical-bridge/L1-clinical-literacy/recist-irecist-response]]
[[medical-bridge/L2-human-molecular-cell-biology/_pathways/pi3k-akt-mtor-core-map]]
[[04-scRNAseq/_papers/macosko-2015-cell-dropseq]]
[[06-spatial/_papers/stahl-2016-science-spatial-transcriptomics]]

我现在的理解状态¶

#待 Peter 确认

参考¶

Tirosh et al. (2016), Science.
Azizi et al. (2018), Cell.
Maynard et al. (2020), Cell.
Macosko et al. (2015), Cell.
Zheng et al. (2017), Nature Communications.